Белок Xmas-2, основной белок комплекса экспорта мРНК TREX-2, не определяет специфичность связывания мРНК Ras2 комплексом

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Комплекс TREX-2 эукариот отвечает за экспорт из ядра в цитоплазму широкого спектра мРНК. Ранее мы показали, что субъединица комплекса TREX-2 D. melanogaster, белок PCID2, имеет домен, специфично взаимодействующий с РНК. Однако, остается неизвестным, участвуют ли другие компоненты комплекса во взаимодействии с таргетной мРНК и в ее узнавании. В настоящей работе мы определяли роль Xmas-2, основной структурной субъединицы комплекса, в специфичном распознавании фрагментов мРНК ras2. В данной работе мы показали, что Xmas-2 взаимодействует с мРНК ras2 независимо от других субъединиц комплекса. Мы показали, что РНК-связывающие домены располагаются как в N-концевом домене, так и C-концевом домене Xmas-2. Однако, взаимодействие белка с фрагментами мРНК ras2 не зависит от последовательности и структуры РНК и является неспецифичным. Таким образом, субъединица Xmas-2 не участвует в распознавании комплексом определенных последовательностей РНК.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

М. М. Куршакова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: d_dmitrieva@mail.ru
Россия, Москва

Ю. А. Вдовина

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: d_dmitrieva@mail.ru
Россия, Москва

С. Г. Георгиева

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: d_dmitrieva@mail.ru

академик РАН

Россия, Москва

Д. В. Копытова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: d_dmitrieva@mail.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Fischer T. et al. The mRNA export machinery requires the novel Sac3p-Thp1p complex to dock at the nucleoplasmic entrance of the nuclear pores. // The EMBO journal. England, 2002. Vol. 21, № 21. P. 5843–5852.
  2. Kurshakova M.M. et al. SAGA and a novel Drosophila export complex anchor efficient transcription and mRNA export to NPC // EMBO Journal. 2007. Vol. 26, № 24.
  3. Lu Q. et al. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. // The Plant journal : for cell and molecular biology. England, 2010. Vol. 61, № 2. P. 259–270.
  4. Luna R., Gonzalez-Aguilera C., Aguilera A. Transcription at the proximity of the nuclear pore: a role for the THP1-SAC3-SUS1-CDC31 (THSC) complex. // RNA biology. United States, 2009. Vol. 6, № 2. P. 145–148.
  5. Wickramasinghe V.O. et al. mRNA export from mammalian cell nuclei is dependent on GANP. // Current biology : CB. England, 2010. Vol. 20, № 1. P. 25–31.
  6. Kopytova D. et al. ORC interacts with THSC/TREX-2 and its subunits promote Nxf1 association with mRNP and mRNA export in Drosophila. // Nucleic acids research. 2016.
  7. Gordon J.M.B., Aibara S., Stewart M. Structure of the Sac3 RNA-binding M-region in the Saccharomyces cerevisiae TREX-2 complex. // Nucleic acids research. 2017. Vol. 45, № 9. P. 5577–5585.
  8. Aibara S., Bai X.-C., Stewart M. The Sac3 TPR-like region in the Saccharomyces cerevisiae TREX-2 complex is more extensive but independent of the CID region. // Journal of structural biology. 2016. Vol. 195, № 3. P. 316–324.
  9. Ellisdon A.M. et al. Structural basis for the assembly and nucleic acid binding of the TREX-2 transcription-export complex. // Nature structural & molecular biology. United States, 2012. Vol. 19, № 3. P. 328–336.
  10. Jani D. et al. Sus1, Cdc31, and the Sac3 CID region form a conserved interaction platform that promotes nuclear pore association and mRNA export. // Molecular cell. United States, 2009. Vol. 33, № 6. P. 727–737.
  11. Stewart M. Structure and Function of the TREX-2 Complex. // Sub-cellular biochemistry. United States, 2019. Vol. 93. P. 461–470.
  12. Wickramasinghe V.O. et al. Selective nuclear export of specific classes of mRNA from mammalian nuclei is promoted by GANP. // Nucleic acids research. England, 2014. Vol. 42, № 8. P. 5059–5071.
  13. Vdovina Y.A. et al. PCID2 Subunit of the Drosophila TREX-2 Complex Has Two RNA-Binding Regions. // Current issues in molecular biology. Switzerland, 2023. Vol. 45, № 7. P. 5662–5676.
  14. Kurshakova M.M., Georgieva S.G., Kopytova D.V. The Xmas-2 Protein of Drosophila melanogaster Undergoes Cleavage into Two Fragments. // Doklady Biochemistry and biophysics. United States, 2023. Vol. 509, № 1. P. 37–40.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Анализ взаимодействия полноразмерного Xmas-2 с фрагментами РНК ras2 гена D. melanogaster. (а) Схема деления ras2 на фрагменты, взятые в эксперимент по связыванию. (б) На рисунке представлены автографы 5% ПААГ. Скобочкой отмечена миграция свободной РНК, а стрелочкой образующиеся комплексы белок-РНК. Концентрация каждого меченого фрагмента РНК в реакции связывания составляла 25 нМ. Представлены результаты взаимодействия GST-Xmas-2: на дорожках 1–5 – с фрагментом 1 ras2; 6–10 – с фрагментом 2 ras2; 11–15 – с фрагментом 3 ras2; 16–20 – с фрагментом 4 ras2. На первой дорожке каждой реплики белок отсутствовал (полосы 1, 6, 11, 16), на каждой копии концентрация GST-Xmas-2 составляла 12,5 нМ – на второй дорожке, 25 нМ – на третьей дорожке, 50 нМ – на четвертой дорожке. На пятой дорожке каждой копии представлен результат связывания 7 нМ GST с РНК. (в) На рисунке представлены KD, посчитанные по результатам, представленным на рис. 1б.

Скачать (214KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Анализ взаимодействия C-Xmas-2 и N-Xmas-2 с фрагментами мРНК ras2. (а, б) Комплексы, образующиеся при связывании N-Xmas-2 и C-Xmas-2 с фрагментами ras2 РНК анализировали на 5% ПААГ. На рисунке представлены автографы. Скобочкой и, в случае белка GST, звездочкой, отмечена миграция свободной РНК, а стрелочкой отмечены образующиеся комплексы белок-РНК. Концентрация меченых [32P]UTP фрагментов мРНК ras2 в реакции связывания составляла 25 нМ. (а) РНК инкубировали с увеличивающимися количествами очищенного GST-N-Xmas-2: дорожки 1, 4, 7, 10 – белок в реакцию не добавлялся; 2, 5, 8, 11 – 5 нМ белка было добавлено в реакцию связывания; 3, 6, 9, 12 – 50 нМ белка было добавлено в реакцию связывания. (б) РНК инкубировали с увеличивающимися количествами очищенного GST-С-Xmas-2: дорожки 1, 4, 7, 12 – белок в реакцию не добавлялся; 2, 5, 8, 10 – 5 нМ белка было добавлено в реакцию связывания; 3, 6, 9, 11 – 50 нМ белка было добавлено в реакцию связывания.

Скачать (166KB)
Метаданные
4. Рис. 3. N-Xmas-2 и C-Xmas-2 осаждают мРНК ras2 из ядерного экстракта S2 клеток. (а) Схема доменной организации белка Xmas-2. На схеме отмечены моделирующие расщепление Xmas-2 сверхэкспрессированные с FLAG-эпитопами белки, содержащие N- и C-концевые фрагменты Xmas-2. (б) Реакции иммунопреципитации мРНК (RIP) ras2 были проведены с использованием антител к FLAG-эпитопу из ядерных экстрактов S2 клеток с сверхэкспрессированными белками FLAG-N-Xmas-2 и FLAG-C-Xmas-2. В качестве контроля был использован неиммунный IgG.

Скачать (88KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024